Sekwencjonowanie DNA - wszystko, co musisz wiedzieć

Oczywiście, aby jakakolwiek informacja mogła zostać zapisana i odtworzona, musi istnieć alfabet na to pozwalający. W tym wypadku stanowią go nukleotydy, a właściwie ich kolejność w cząsteczce DNA. Odczytywanie kolejności nukleotydów nazywa się sekwencjonowaniem DNA. Rozwój metod pozwalających na czytanie alfabetu genetycznego został zapoczątkowany w latach 70, długo po odkryciu faktu iż to właśnie DNA jest cząsteczką odpowiedzialną za przekazywanie informacji genetycznej. W tym czasie prawie równocześnie dwa zespoły badawcze opracowały technologie pozwalające na sekwencjonowanie DNA. Obydwie z tych technologii zaliczane są dziś do metod sekwencjonowania pierwszej generacji. Pierwsza z nich opracowana przez dwóch badaczy - Gilberta i Maxama zdobyła popularność, która szybko została przyćmiona odkryciem metody sekwencjonowania nazwanej sekwencjonowaniem Sangera (od nazwiska jej odkrywcy).

Frederick Sanger za swoje odkrycie już w 1980 roku został nagrodzony Nagrodą Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny.

Początki sekwencjonowania DNA

Początkowo praca nad sekwencjonowaniem genów albo kompletnej informacji genetycznej całych organizmów była zajęciem bardzo żmudnym, pracochłonnym i czasochłonnym. Dopiero zautomatyzowanie tego procesu umożliwiło dalszy rozwój technik opartych na sekwencjonowaniu Sangerowskim. W 1986 roku firma o nazwie Applied Biosystems rozpoczęła produkcję automatów służących do sekwencjonowania DNA w oparciu o metodę Sangera. Maszyny te używały barwników, za pomocą których możliwe było oznaczenie poszczególnych nukleotydów, umożliwiając uproszczenie procesu sekwencjonowania dzięki czytaniu nukleotydów poprzez „ich kolor”. Co ciekawe, maszyny te kosztujące 100 000 dolarów pozwalały na sekwencjonowanie 24 próbek na raz, co dawało 12.000 "liter" DNA dziennie. Mimo że maszyny były droższe niż tradycyjne szklane płytki i żele, gdy inwestycja została dokonana, dostarczenie danych przez urządzenia Applied Biosystem było tańsze i szybsze niż tradycyjne metody.

Właśnie takie urządzenia zostały wykorzystane przez Craiga Ventera w projekcie nazwanym „Human Genome Project”, którego celem było zsekwencjnowanie pierwszego genomu człowieka. Projekt rozpoczął się w 2001 roku, trwał 6 lat i kosztował 3mld $.

Chociaż dostarczanie jednej sekwencji ludzkiego genomu było niezwykłym osiągnięciem, to w celu manipulowania dużymi ilościami DNA były potrzebne dalsze postępy w technologii sekwencjonowania. Porównanie różnic między długimi odcinkami DNA (liczonymi w milionach par zasad) pobranymi od wielu osób, powinno przynieść ogromną ilość informacji na temat roli dziedziczenia, podatności na choroby, odpowiedzi na wpływy środowiska, a nawet ewolucji.

Sekwencjonowanie DNA to proces kosztowny

Mimo iż możliwa była automatyzacja procesu sekwencjonowania, to sekwencjonowanie całych genomów, względy czasowe i koszty nadal sprawiały, że był to proces dość drogi. Ograniczyło to liczbę genomów, których sekwencjonowanie zostało z powodzeniem zakończone. Z biegiem czasu, technologia sekwencjonowania (i technologia syntezy DNA) została rozszerzona o bardziej wyrafinowane strategie rozdzielania cząsteczek DNA o różnej długości oraz alternatywne strategie wizualizacji i możliwości sekwencjonowania większej ilości próbek równolegle. W efekcie współczesne maszyny mogą zazwyczaj przeprowadzić proces sekwencjonowania 96 próbek w tym samym czasie. Ponadto, podczas gdy tradycyjne, pierwsze maszyny oparte na rozdziale cząsteczek DNA w żelu mogły generować tylko 250 do 500 par zasad sekwencji DNA na reakcję, obecnie może być odczytywane od 750 do 1000 par zasad sekwencji z jednej reakcji, natomiast koszt generowania takiej ilości danych jest znacznie mniejszy niż kiedyś. Ponadto zostały opracowane technologie sekwencjonowania, które nie wykorzystują żeli. Umożliwiło to znaczne zwiększenie wydajności sekwencjonowania.

Sekwencjonowanie nowej generacji

(Określane również sekwencjonowaniem masowym i równoległym lub sekwencjonowaniem drugiej generacji), NGS czyli nowe technologie sekwencjonowania pozwoliły w dużej mierze na zastąpione technologii pierwszej generacji. Nowsze metody umożliwiają sekwencjonowanie wielu fragmentów DNA (czasami rzędu milionów fragmentów) w jednym czasie. Co więcej, są one bardziej ekonomiczne niż technologie pierwszej generacji. Przebiegają również znacznie szybciej niż one. Użyteczność technologii następnej generacji była znacząco poprawiona dzięki postępowi w dziedzinie bioinformatyki, co pozwoliło na zwiększenie magazynowania danych oraz analizę i ułatwienie manipulowania bardzo dużymi zbiorami danych, często w zakresie miliard par zasad DNA.

Obecnie są prowadzone prace nad rozwinięciem technologii sekwencjonowania trzeciej generacji. Technologie trzeciej generacji mają na celu zwiększenie wydajności i zmniejszenie czasu otrzymania wyników, a także zredukowania kosztów badań genetycznych. Może być to możliwe poprzez eliminowanie nadmiernego użycia odczynników i wykorzystaniu właściwości polimerazy DNA.

Znajomość sekwencji segmentu DNA ma wiele zastosowań

Po pierwsze, mogą być one wykorzystywane w celu znalezienia nowych genów lub segmentów DNA, które kodują określone białka, albo są odpowiedzialne za konkretną cechę danego organizmu. Jeśli region DNA został zsekwencjnowany, to może on zostać przeszukany pod kątem znalezienia cech charakterystycznych dla danych genów. Ponadto, możliwe jest znajdowanie genów lub fragmentów DNA, które powiązane są z występowaniem danej choroby. Homologiczne sekwencje DNA z różnych organizmów, czyli sekwencje kodujące ten sam gen, mogą być porównywane w celu określenia ewolucyjnych związków w obrębie i między gatunkami. To oczywiście nie wszystkie możliwości będące skutkiem poznania sekwencji DNA. Może być ona także źródłem wiedzy na temat regionów funkcjonalnych poszczególnych białek organizmu.

W celu określenia funkcji genu, mogą być identyfikowane części białek, które są wspólne dla białek o podobnych funkcjach. Dzięki temu, możliwe jest przewidywanie funkcji białek o nieznanych funkcjach. Na przykład, niektóre sekwencje DNA odpowiedzialne za kodowanie białek budulcowych błonę komórkową są zawsze takie same; takie fragmenty białek są nazywane domenami transbłonowymi. Jeśli domena transbłonowa znajduje się w genie o nieznanej funkcji, sugeruje to, że kodowane białko znajduje się w błonie komórkowej. W podobny sposób można identyfikować białka biorące udział w innych ważnych procesach komórkowych.

Informacje o sekwencji DNA uzyskane przez laboratoria HGP są swobodnie dostępne dla naukowców poprzez GenBank, w bazie danych prowadzonej przez amerykańskie National Institutes of Health i National Library of Medicine w National Center for Biotechnology Information. Dostęp do tej bazy danych jest również całkowicie bezpłatny dla każdej zainteresowanej osoby.

Technologie sekwencjonowania umożliwiły powstanie tak zwanej genetyki spersonalizowanej. W dzisiejszych czasach każdy może zsekwencjonować pojedyncze geny lub teoretycznie także cały swój genom za pomocą badań genetycznych takich jak badanie WES, co umożliwia określenie ryzyka pewnych opisanych chorób - np. nowotworów złośliwych (takich jak rak jelita grubego, piersi, jajnika, prostaty czy czerniaka). Do wykonania takiego testu DNA jest niezbędna próbka zawierająca materiał genetyczny pacjenta. Najczęściej jest to próbka krwi lub śliny, którą można pobrać także w domu.